Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
Государственные санитарно-эпидемиологические
правила и гигиенические нормативы
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод
микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Penicillium canescens F-832
- продуцента ксиланазы
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1783-03
МИНЗДРАВ РОССИИ
МОСКВА 2004
Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра
здравоохранения Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
24 октября 2003 г.
Дата введения: 1 декабря 2003 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Penicillium canescens F-832 –
продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1783-03
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента ксиланазы
Микроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой. На твердом сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, диаметром 2 - 3 мм. На 4 - 5 сутки инкубации размеры колонии достигают 5 - 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний оранжево-коричневая.
Штамм устойчив практически ко всем широко известным антибиотикам.
ПДК штамма в воздухе рабочей зоны 2000 кл/м3, А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Прямой метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды (сусло-агар) и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением ´ 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические
плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и
35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики: группы пенициллина,
тетрациклина, цефалоспорина и др.
амфотерицин или нистатин
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Среда для штамма-продуцента: агаризованное
пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента
(агар - 1,8 %, рН 5,9 - 6,1, режим стерилизации
1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин)
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента.
Состав среды: КН2РО4 - 1 г; MgSO4×7Н3О -
0,5 г; (NH4)2SO4 - 0,7 г; целлюлоза порошковая
в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза -
0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г;
вода дистиллированная - до 1000 мл
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента ксиланазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Прямой метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3 - 5 сутки после посева воздуха и позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (пенициллин, стрептомицин, цефалотин или другой), для подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина или амфотерицина 15 мкг/мл для подавления грибковой флоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
При выполнении анализа воздуха рабочей зоны косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 30 °С. На 3 - 5 сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента по культурально-морфологическим признакам или по зонам просветления вокруг колоний как результат действия ксиланазы на окрашенную целлюлозу. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл./м3, где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2.
Составляем пропорцию:
на 100 см2 за 1 мин оседает 2 л воздуха
на 78,54 см2 Х л
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 м3 воздуха.
На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57Т л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3 воздуха содержится
.
Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха содержится
12×636,9/30 = 253 клетки.
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма Penicillium canescens F-832
- продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны
|
1. Дата проведения анализа ___________________________________________________ |
|
2. Место отбора пробы _______________________________________________________ |
|
3. Название лаборатории _____________________________________________________ |
|
4. Юридический адрес организации ___________________________________________ |
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл./м3 |
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. 7 с.
СОДЕРЖАНИЕ